密理博ECL發(fā)光液的使用方法：

　　1.使用合適的方法進(jìn)行Western，直至用PBST洗滌二抗。

 

　　2.新鮮配制ECL工作液：試劑I和試劑II按1:1混合后，用雙蒸水10倍稀釋，混合后即為ECL工作液。須立即使用。

 

　　3.印跡膜蛋白面朝上，用ECL工作液均勻滴加至印跡膜室溫孵育1-2分鐘。ECL工作液使用量大約為0.125ml/cm2膜或根據(jù)個(gè)人實(shí)驗(yàn)習(xí)慣使用。

 

　　4.用平頭鑷夾住印跡膜，垂直置于吸水紙以吸去多余工作液。

 

　　5.快速將印跡膜置于二層保鮮膜之間，盡量趕盡氣泡。

 

　　6.將印跡膜蛋白面朝上，放于X光膠片暗盒內(nèi)。

 

　　7.在暗室內(nèi)放入X光片，曝光，顯影。

 

　　密理博ECL發(fā)光液的注意事項(xiàng)：

　　（1）可在日光燈下操作；但發(fā)光液曝露于強(qiáng)光下時(shí)間過(guò)久靈敏度可能略有降低，移到暗房操作可避免之。戴手套可以避免在膜上留下手印。

 

　　（2）長(zhǎng)時(shí)間曝光或蛋白過(guò)量，將加深背景并使條帶強(qiáng)弱變化失去線性關(guān)系。曝光不足則條帶模糊。

 

　　（3）發(fā)光工作液孵育約3分鐘后膜上的條帶發(fā)光。強(qiáng)條帶發(fā)光在暗房中肉眼可見(jiàn)，低豐度蛋白條帶發(fā)光較弱甚至肉眼不可見(jiàn)但可使X光膠片曝光。不能簡(jiǎn)單以肉眼觀察判斷條帶發(fā)光時(shí)間。肉眼不可見(jiàn)的熒光實(shí)際上可持續(xù)數(shù)小時(shí)并使X光膠片感光，因而弱帶可曝光1-10小時(shí)。如果曝光后條帶不佳，可用洗膜緩沖液洗膜，重新孵育二抗，然后重新用ECL發(fā)光和曝光。

 

　?。?）由于密理博ECL發(fā)光液極其靈敏，強(qiáng)烈推薦大多數(shù)進(jìn)口抗體起始濃度為一抗1:1000～1:4000，二抗1:2000～1:5000?？贵w濃度過(guò)高將造成高背景或沒(méi)有條帶，導(dǎo)致失敗。

 

　?。?）某些保鮮膜包裹印跡膜時(shí)可能會(huì)淬滅熒光，應(yīng)選擇高質(zhì)量保鮮膜。

 

　?。?）使用肉眼可見(jiàn)的預(yù)染色蛋白Marker和熒光-放射自顯影曝光標(biāo)簽可精確確定膠片上條帶的位置和大小。

 

　　（7）NaN3能抑制HRP活性，回收第二抗體應(yīng)避免使用NaN3，如必需使用勿超過(guò)0.01%。