共聚焦成像——如何讓細(xì)胞在玻璃底培養(yǎng)皿更好地貼壁

今天分享下如何處理玻璃底培養(yǎng)皿、如何選擇玻璃底培養(yǎng)皿，讓細(xì)胞妥妥地貼壁，大家做共聚焦時(shí)候能夠更得心應(yīng)手。

   市面上常見的玻璃底培養(yǎng)皿，通常是在塑料培養(yǎng)皿底部打個(gè)洞，再將厚度為170-220μm的蓋玻片或細(xì)胞爬片用無影膠水或硅膠粘于培養(yǎng)皿底部。并不是整個(gè)培養(yǎng)皿的底部都是玻璃材質(zhì)的。適用于觀測的區(qū)域僅僅在打孔的區(qū)域。但是由于玻璃的疏水性，往往在培養(yǎng)細(xì)胞的時(shí)候，細(xì)胞不能在玻璃上很好地貼壁，生長狀態(tài)并不好，甚至在做共聚焦掃描成像的時(shí)候發(fā)生細(xì)胞脫片的現(xiàn)象。

想要細(xì)胞好好貼壁，所使用的玻璃底培養(yǎng)皿進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)之前，要確認(rèn)已經(jīng)包被了特定的蛋白試劑。

自己動(dòng)手包被

     培養(yǎng)不同的細(xì)胞，需要的包被試劑也不同。同時(shí)，因?yàn)橛糜诎坏牡鞍资巧锂a(chǎn)物，所以不同公司的包被蛋白的產(chǎn)品純度和用量都是不同的，本技術(shù)帖只是提供參考，具體的包被試劑用量還是要參考所用品牌的說明書。并且最好以自己所用的試劑先做一個(gè)梯度實(shí)驗(yàn)，找出適合的包被濃度。

     這里以 Poly-L-Lysine 為例（PLL，sigma，P4832, 100μg/ml）：

   PLL包被適用于絕大多數(shù)細(xì)胞，尤其適用于中樞系統(tǒng)神經(jīng)元的培養(yǎng)。在使用時(shí)需要使單位面積上的蛋白含量（μg/cm2）達(dá)到理想的量。本例中PLL推薦包被的用量為 2μg/cm2。需要根據(jù)包被面積，包被體積，來計(jì)算所需要蛋白質(zhì)的量。

    比如：35mm玻璃底培養(yǎng)皿，細(xì)胞生長面積是3.5cm2，包被面積是4.1cm2，包被液體積是400μl，那根據(jù)推薦用量2μg/cm2。那么單孔中需要8.2μg的PLL，如果只加入400μl的PLL溶液，那PLL的溶液濃度為20.5μg/ml（約為 20μg/ml）。所以，需要用超純水將原液進(jìn)行稀釋。

具體步驟：

1.使用超純水按照1:5稀釋PLL原液。

2.在每個(gè)35mm玻璃底培養(yǎng)皿中加入400μl的PLL稀釋液。

3.室溫孵育1-2小時(shí)，吸出PLL稀釋液。

4.使用2ml PBS溶液或無血清培養(yǎng)基小心的清洗3次，吸盡清洗液。

5.直接加入細(xì)胞懸液進(jìn)行培養(yǎng)。

方法評價(jià)

    由于各種包被蛋白的性質(zhì)不同，不同的包被蛋白使用方法也不一樣。經(jīng)常由于需要對玻璃底培養(yǎng)皿包被，而產(chǎn)生了新的污染。而且污染往往是開始養(yǎng)細(xì)胞了以后才會(huì)發(fā)現(xiàn)，這樣不僅耽誤了時(shí)間，而且也浪費(fèi)了試劑盒耗材。畢竟包被蛋白試劑和質(zhì)量有保證的玻璃底培養(yǎng)皿價(jià)格也是不菲的（質(zhì)量不過關(guān)的玻璃底培養(yǎng)皿有可能會(huì)因?yàn)槟z水沒有粘勻而漏液或者使用的膠水對細(xì)胞有毒性）。

無需包被的共聚焦培養(yǎng)皿

      對于想節(jié)省時(shí)間和功夫的童鞋，還是直接使用無需包被的共聚焦培養(yǎng)皿更為方便些。

     選擇合適的培養(yǎng)皿需要考慮的因素有：是否適合自己的細(xì)胞貼壁、培養(yǎng)皿的光學(xué)特性是否符合共聚焦要求。

     能符合上述因素要求的培養(yǎng)皿，不局限于帶包被的玻璃底培養(yǎng)皿，事實(shí)上，大家都知道塑料培養(yǎng)皿更便宜、相對玻璃來說，也更容易讓細(xì)胞貼壁。這里以德國ibidi的共聚焦培養(yǎng)皿為例，說一下符合共聚焦實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)皿需要具備哪些參數(shù)：

            圖  德國ibidi共聚焦培養(yǎng)皿和高質(zhì)量玻璃底培養(yǎng)皿的底部參數(shù)對比

      可以看出，符合直接使用要求的共聚焦培養(yǎng)皿，它們的物理參數(shù)都是非常接近玻璃的，但同時(shí)，它們又還具有親水的特性，能讓大多數(shù)細(xì)胞更好貼壁；而且透氣性和延展性都要比玻璃更好。比如這里舉例的ibidi培養(yǎng)皿，就可讓絕大多數(shù)細(xì)胞系和原代細(xì)胞直接貼壁生長，而且不易碎，算是不錯(cuò)的選擇。

   大家也可根據(jù)自己具體實(shí)驗(yàn)要求，結(jié)合上述表格的參數(shù)，找到最合適自己實(shí)驗(yàn)的共聚焦培養(yǎng)皿。

方法評價(jià)

     選擇這類培養(yǎng)皿，不需要額外包被，大大減少了污染的風(fēng)險(xiǎn)。并且由于塑料底部比較易于加工，不需要膠水就能使其固定在培養(yǎng)皿底部。杜絕了漏液或者細(xì)胞毒性的可能。

高通量共聚焦實(shí)驗(yàn)耗材

  由于單個(gè)培養(yǎng)皿通量很小，如果一次要做多個(gè)樣品，操作就會(huì)比較麻煩，且試劑用量會(huì)較大，這時(shí)候可以選擇多孔的耗材，比如腔室載玻片（2/4/8孔），可以滿足研究人員需要一次進(jìn)行多通量的成像。并且相對于傳統(tǒng)的共聚焦培養(yǎng)皿，腔室載玻片需要試劑的更少，非常節(jié)約價(jià)格昂貴的抗體，單孔實(shí)驗(yàn)的成本大大降低。

      現(xiàn)在也有適用于高內(nèi)涵顯微鏡和活細(xì)胞工作站的多孔板。適合全自動(dòng)成像和操作。